Iuri Gagarin a murit în urmă cu 55 de ani, pe 27 martie 1968, în timp ce efectua un zbor de antrenament cu un avion MiG-15 UTI, alături de instructorul său Vladimir Sereghin.

Avionul lor a decolat dimineața, la ora 10:18, de pe aerodromul Cikalovski de lângă Moscova. Echipajul ar fi trebuit să efectueze exerciții în zona de zbor timp de cel puțin 20 de minute, dar la ora 10.30 Gagarin a raportat sfârșitul misiunii și a cerut permisiunea de a se întoarce la aerodrom.

Câteva minute mai târziu, avionul s-a prăbușit în apropierea satului Novoselovo, regiunea Vladimir. Ambii piloți au murit. Gagarin avea 34 de ani, iar Serioghin 45 de ani. Din cauza morții lui Gagarin, URSS a declarat doliu de stat. Urnele cu cenușa celor decedați au fost îngropate în zidul Kremlinului.

Ancheta privind accidentul a rămas secretă pentru o lungă perioadă de timp. O comisie rusă de stat a ajuns la concluzia că echipajul, dintr-un motiv necunoscut, a făcut o manevră bruscă și a intrat într-o rotire, din care nu a reușit să iasă. Nu au fost înregistrate defecțiuni sau defecțiuni ale echipamentelor de la bord. 

Raportul KGB, declasificat în martie 2003, susținea că acțiunile personalului bazei aeriene au contribuit la prăbușire. În raport se afirmă că un controlor de trafic aerian i-a furnizat lui Gagarin informații meteo învechite și că, în momentul zborului, condițiile se deterioraseră semnificativ. De asemenea, personalul de la sol a lăsat rezervoarele externe de combustibil atașate la aeronavă. Activitățile de zbor planificate de Gagarin aveau nevoie de vreme senină și fără rezervoare exterioare.

Ancheta a concluzionat că aeronava lui Gagarin a intrat în rotație, fie din cauza unei lovituri de pasăre, fie din cauza unei mișcări bruște pentru a evita o altă aeronavă. Din cauza informațiilor meteo neactualizate, echipajul a crezut că altitudinea era mai mare decât în realitate și nu a putut reacționa corespunzător pentru a scoate MiG-15 din rotație.

O altă teorie, avansată în 2005 de către investigatorul inițial al accidentului, presupune că o gură de aerisire a cabinei a fost lăsată deschisă în mod accidental de către echipaj sau de către pilotul anterior, ceea ce a dus la lipsa de oxigen și a lăsat echipajul incapabil să controleze aeronava. O teorie similară, publicată în revista Air & Space, este că echipajul a detectat gura de aerisire deschisă și a urmat procedura executând o scufundare rapidă la o altitudine mai mică. Această scufundare i-ar fi făcut să își piardă cunoștința și să se prăbușească.

La 12 aprilie 2007, Kremlinul a pus veto la o nouă anchetă privind moartea lui Gagarin. Oficialii guvernamentali au declarat că nu văd niciun motiv pentru a începe o nouă investigație. În aprilie 2011, au fost declasificate documente ale unei comisii din 1968, înființată de Comitetul Central al Partidului Comunist pentru a investiga accidentul. Potrivit documentelor, concluzia inițială a comisiei a fost că Gagarin sau Serioghin au efectuat o manevră bruscă, fie pentru a evita un balon meteorologic, fie pentru a evita intrarea în limita superioară a primului strat de nori, ceea ce a condus avionul într-un regim de zbor supercritic și la blocarea acestuia în condiții meteorologice complexe.